L-型電壓依賴型鈣通道β抗體免疫熒光技術(shù)的實(shí)驗(yàn)步驟：

一、準(zhǔn)備好試劑與儀器：

磷酸鹽緩沖鹽水、熒光標(biāo)記的抗體溶液、緩沖甘油、搪瓷桶三只、有蓋搪瓷盒一只、熒光顯微鏡、玻片架、濾紙、37℃溫箱等。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1.滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標(biāo)本片上，十分鐘后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度。

2.滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液，使其完全覆蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫一定時(shí)間以三十分鐘為參考。

3.取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸三到五分鐘，并不停地?fù)u晃振蕩。

4.取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。

5.立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度。

   

抗體分子標(biāo)記技術(shù)：

（一）原理

當(dāng)應(yīng)用化學(xué)氧化法時(shí)(NaI)遇強(qiáng)氧化劑,離子被氧化為分子,所生成的自由分子可與某些基團(tuán)進(jìn)行鹵化反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子可進(jìn)行鹵化反應(yīng)的基團(tuán)主要為酪氨酸殘基,某些組氨酸殘基也可能進(jìn)行化。在應(yīng)用胺T( Chloramine T)法的實(shí)驗(yàn)中,所用的氧化劑(1,3,4,6- tetrachloro-3a,6adipheny l-glucoluril)強(qiáng)揮發(fā)性的有機(jī)溶劑中。該溶劑加入試管后,先讓其揮發(fā)(即讓氧化劑將試管包被),然后把Na125I和蛋白質(zhì)液加入包被好的試管中,反應(yīng)完成即將混合液移入他管終止反應(yīng)。

（二）準(zhǔn)備

1.試劑

經(jīng)親和層析純化的多克隆抗體或單克隆抗體；0.5mol/L磷酸鈉緩沖液,pH7.5；無載體的Na125I3.7GBq/ml(100mCi/ml)的NaOH液；100g/L三醋酸；70%乙醇；新鮮制備的含2mg/m1絡(luò)胺T的0.5mol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.5）；胺T反應(yīng)終止緩沖液；

2.儀器

凝膠過濾柱；￥-記數(shù)器；玻璃纖維濾。

（三）操作要點(diǎn)

1.用胺T法進(jìn)行化,也可在大約pH7.0的緩沖液中進(jìn)行；

2.如果氧化反應(yīng)損傷蛋白質(zhì)，可將抗體與異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián))胺T量減少到0.02mg/m，并將偏重亞硫酸液的濃度降到0.024mg/ml；

3. Iodogen-包被的試管可在干燥器中,于室溫下保存多年；

4.1251標(biāo)記的抗體,在制備后六周內(nèi)均可使用(1251的半衰期為59.6天）；

5.要注意保證所用的Na1251是新鮮的,陳舊制劑的比活性低；

6.酪氨酸的碘化偶爾會對抗原的抗體結(jié)合位點(diǎn)有干擾,因此降低其結(jié)合能力,但這種情況很少見。
293(人胚腎細(xì)胞)
5637(人膀胱癌細(xì)胞)
293A (人胚腎細(xì)胞)
22RV1(人前列腺癌細(xì)胞)
293T(人胚腎細(xì)胞)
3T3-L1(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)
4T1(小鼠乳腺癌細(xì)胞)
6T-CEM (人T細(xì)胞白血病細(xì)胞)
769-P(人腎細(xì)胞腺癌細(xì)胞)
786-O(人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞)
95-D(人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞)
A172(人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞)
A2780(人卵巢癌細(xì)胞)
A-375(人惡性黑色素瘤細(xì)胞)
A-431(人表皮癌細(xì)胞)
A549(人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞)
A673(人橫紋肌瘤細(xì)胞)
A9(小鼠皮下結(jié)締組織細(xì)胞)
AAV-293(人胚腎細(xì)胞)
Acc-2(人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞)
ACHN(人腎癌細(xì)胞)
AGS(人胃腺癌細(xì)胞)
Ana-1(小鼠巨噬細(xì)胞)
Anglne(人卵巢癌細(xì)胞)
AR42J(大鼠胰腺外分泌細(xì)胞)
ARPE-19(人視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞)
AsPC-1(人胰腺癌細(xì)胞)
AtT-20(小鼠垂體瘤細(xì)胞)
B16(小鼠黑色素瘤細(xì)胞)
Bcap-37(人乳腺癌細(xì)胞)
BEL-7402(人肝癌細(xì)胞)
BEL-7404(人肝癌細(xì)胞)
BGC823(人胃癌細(xì)胞)
BHK-21(倉鼠腎細(xì)胞)
BIU-87(人膀胱癌細(xì)胞)
BRL-3A(大鼠正常肝細(xì)胞)
BNL CL.2(小鼠胚胎肝細(xì)胞)